Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Проект направлен на исследование влияния различных последовательностей ДНК и локального состава хроматина на регуляцию экспрессии генов. Данный проект основан на использовании новейшего метода мультиплексного анализа TRIP (Thousands of Reporters Integrated in Parallel), который позволяет одновременно измерять уровень транскрипционной активности большого числа (до десятков тысяч), как интегрированных случайным образом в геном, так и не интегрированных в геном, трансгенов. Метод TRIP основан на piggyBac-опосредованной транспозиции в геном культивируемых клеток ДНК-маркированных (штрих-кодированных) репортёрных конструкций с последующей идентификацией сайтов их локализации в геноме и анализом их транскрипционной активности посредством высокопроизводительного параллельного секвенирования. Первая часть проекта связана с изучением активности промоторов разных типов в разных локальных окружениях хроматина в культивируемых клетках Drosophila melanogaster. Выбор модельного объекта для проекта был обусловлен тем, что для этих клеток имеются обширные массивы информации по взаимодействию компонентов хроматина с геномом, что позволит провести широкомасштабный анализ зависимости транскрипционной активности от локального состава хроматина. В рамках первого года выполнения проекта метод TRIP был успешно адаптирован для культивируемых клеток дрозофилы линий Kc167 и S2, для чего потребовалось найти оптимальные условия доставки репортёрных конструкций в геном этих клеток: [1] был усовершенствован протокол по трансфекции культивируемых клеток дрозофилы методом электропорации (впервые удалось существенно повысить эффективность трансфекции со стандартных 20–30% до 92–96%), [2] подобраны наиболее удачные условия для кратковременной экспрессии транспозазы piggyBac (использование промоторов генов actin5c и Hsp70 дрозофилы для клеток линий Kc167 и S2, соответственно, а также кратковременная активация химерной транспозазы piggyBac ("pBac-L3-ERT2") посредством тамоксифена) и [3] сконструированы уникально маркированные TRIP-векторы для последующего одновременного исследования активности разных промоторов в едином большом эксперименте. Для анализа отличий в поведении промоторов, помещённых в различные локусы генома, на основе литературных данных были выбраны несколько промоторов дрозофилы c различным уровнем активности: промоторы конститутивно активных генов Tbp (TATA binding protein), PCNA (Proliferating cell nuclear antigen), HexA (Hexokinase A) и PyK (Pyruvate kinase), а также индуцируемые промоторы генов Hsp70 (Heat-shock-protein-70) и MtnA (Metallothionein A). Для каждого промотора было создано две конструкции, различающиеся уникальными промоторными индексами, чтобы исключить возможное влияние промоторного индекса на экспрессию репортёрного гена. Была определена активность промоторов в культивируемых клетках дрозофилы S2 и Кс167 после кратковременной трансфекции клеток полученными плазмидными конструкциями с помощью проточной цитометрии по флуоресценции eGFP и посредством определения уровня экспрессии репортёрного гена eGFP методом обратной транскрипции и последующей ПЦР в реальном времени. Установлено, что в культивируемых клетках дрозофилы S2 и Кс167 набор выбранных для TRIP-анализа промоторов демонстрирует транскрипционную активность в широком динамическом диапазоне (от относительно малоактивного промотора гена MtnA до высокоактивных промоторов генов HexA и Hsp70). Также показано, что последовательности использованных промоторных индексов не оказывают влияния на уровень транскрипционной активности репортёрного гена. На основе выбранных шести промоторов были созданы штрих-кодированные плазмидные библиотеки достаточной сложности (не менее 400 тысяч клонов каждая) и выполнена проверка их качества. Эти штрих-кодированные библиотеки будут использованы для получения TRIP-популяций клеток на следующем году выполнения проекта. Вторая часть проекта связана с исследованием процесса регуляции терминации транскрипции, а именно анализом регуляторных мотивов, расположенных после сигналов полиаденилирования. В рамках первого года выполнения проекта нами был подробно исследован феномен влияния однонуклеотидной делеции, локализующейся на расстоянии 31 п.н. после сигнала полиаденилирования, на увеличение количества транскриптов модельного репортёрного гена (eGFP). Так, было установлено, что эффект от делеции одного нуклеотида в 3ʹ области репортёрного гена eGFP не является ткане- и видоспецифическим, так как выявляется в двух типах культивируемых клеток мыши и в культивируемых клетках человека. У дрозофилы этот эффект обнаружен не был. Кроме того было выявлено, что затрагиваемый данной делецией нуклеотид не входит в большинство зрелых молекул мРНК. Было установлено, что в норме разрезание молекул пре-мРНК в культивируемых клетках человека HEK293T происходит по целому ряду сайтов, располагающихся после сигнала полиаденилирования в интервале длиной более 40 нуклеотидов. Мы проанализировали с какой частотой используется каждый сайт разрезания пре-мРНК. Оказалось, что лишь в 17% случаев разрезание пре-мРНК происходит по известному из литературных данных динуклеотиду CA, тогда как в остальных случаях используются другие сайты. Мы обнаружили, что исследуемая нами однонуклеотидная делеция приводит к увеличению частоты использования сайтов разрезания пре-мРНК, расположенных ближе к сигналу полиаденилирования. Мы предполагаем, что анализируемая однонуклеотидная делеция нарушает или, наоборот, создаёт сайт связывания какого-то РНК- или ДНК-связывающего белка, существенного для определения места разрезания молекул пре-мРНК в клетках человека. В целом, результаты проекта будут иметь важное фундаментальное значение в понимании регуляции экспрессии генов эукариот, а также практическое применение в плане развития геномных технологий, генетической инженерии и биотехнологий.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проект направлен на исследование влияния различных последовательностей ДНК и локального состава хроматина на регуляцию экспрессии генов. Данный проект основан на использовании новейшего метода мультиплексного анализа TRIP (Thousands of Reporters Integrated in Parallel), который позволяет одновременно измерять уровень транскрипционной активности большого числа (до десятков тысяч), как интегрированных случайным образом в геном, так и не интегрированных в геном, трансгенов. Оригинальный метод TRIP основан на piggyBac-опосредованной транспозиции в геном культивируемых клеток ДНК-маркированных (штрих-кодированных) репортёрных конструкций с последующей идентификацией сайтов их локализации в геноме и анализом их транскрипционной активности посредством высокопроизводительного параллельного секвенирования. Первая часть проекта связана с изучением активности промоторов разных типов в разных локальных окружениях хроматина в культивируемых клетках Drosophila melanogaster. Выбор модельного объекта для проекта был обусловлен тем, что для этих клеток имеются обширные массивы информации по взаимодействию компонентов хроматина с геномом, что позволит провести широкомасштабный анализ зависимости транскрипционной активности от локального состава хроматина. В рамках второго года мы завершили подбор условий постановки TRIP-экспериментов для нашей модельно системы. Была обнаружена и использована в дальнейшей работе мутантная версия промотора гена MtnA[C273G] с повышенной активностью экспрессии (в 28 раз) по сравнению с исходным вариантом MtnA. Было установлено, что детектируемое количество транспозазы piggyBac (PB-L3-ERT2), необходимой для интеграции репортёрных генов в случайные места генома, нарабатывается в культивируемых клетках дрозофилы только при использовании промотора гена actin5c. Были определены оптимальные концентрации индукторов (CuSO4 для активации промотора MtnA[C273G] и 4-гидрокситамоксифена – для активируемой версии транспозазы piggyBac (PB-L3-ERT2)), не снижающие значительно жизнеспособность обрабатываемых клеток. Мы оптимизировали условия интеграции трансгенных конструкций, созданных на основе транспозона piggyBac, в геном культивируемых клеток дрозофилы. Так, мы обнаружили, что при соотношении “транспозон”:“транспозаза” 30:1, используемом при трансфекции клеток Kc167 удается получить максимальное количество встроек трансгенов на клетку (0,62 шт./кл). Кроме того, мы получили стабильную поликлональную линию, несущую встройки репортёрной конструкции в геном. В настоящий момент мы получаем из нее референсные моноклональные линии с известным числом копий репортёрной конструкции в геноме. Мы выполнили всю необходимую пробоподготовку образцов для определения (1) нормированного уровня экспрессии и (2) геномных сайтов локализации штрих-кодированных репортёрных конструкций методом TRIP. Мы получили первые результаты об активности разных по силе и способности к индукции промоторов HexA, Hsp70, MtnA[C273G], PCNA, PyK и Tbp в разных локальных окружениях хроматина. Так, мы одновременно проанализировали культивируемые клетки дрозофилы, суммарно несущие более 13 тысяч интегрированных в случайные места генома штрих-кодированных репортёрных конструкций. Были получены и обработаны все необходимые экспериментальные данные для определения транскрипционной активности всех этих штрих-кодированных репортёров. Оказалось, что значительная доля трансгенов интегрированных в геном культивируемых клеток Kc167 дрозофилы является транскрипционно неактивной. Таким образом, впервые выявлено значительное количество молчащих трансгенов и места их локализации в геноме, что ранее было невозможно при использовании других подходов. Исследованные трансгены демонстрируют широкий динамический диапазон своей активности (до 6000 раз), что указывает на колоссальное влияние локального окружения хроматина на активность интегрированных в геном трансгенов. Судя по анализу данных беспромоторной репортёрной конструкции, этот эффект может быть связан с особенностями клеток дрозофилы. Кроме того, свой вклад вносят и особенности регуляции исследованных промоторов. Мы выявили, что активность промоторов генов значительно изменяется в зависимости от статуса (интегрирован или и не интегрирован в геном): для эписомальной экспрессии одним из самых сильных в нашей системе был промотор гена HexA, который при встраивании в геном – становится средним по силе. В то же время, такой промотор как PCNA оказался способным преодолевать репрессирующее воздействие локального окружения хроматина. Дополнительным свидетельством о том, что использованный нами экспериментальный подход работает адекватно, стал факт, что конструкции без промотора и с промотором гена MtnA (без индукции катионами меди) продемонстрировали ожидаемую наименьшую транскрипционную активность. Вторая часть проекта связана с исследованием процесса регуляции терминации транскрипции, а именно анализом регуляторных мотивов, расположенных после сигналов полиаденилирования. Для этого, в рамках второго года, мы оптимизировали метод капельной ПЦР в эмульсии в сочетании с последующим высокопроизводительным параллельным секвенированием: 1) мы снизили образование гибридных продуктов ПЦР до 0,22% в тестовой системе 2) мы подобрали условия проведения капельной ПЦР, уменьшив количество матрицы и снизив число циклов реакции; 3) мы создали штрих-кодированные плазмидные библиотеки для целого ряда мутированных 8-ми нуклеотидных районов, располагающихся после сигнала полиаденилирования; 4) мы подобрали условия для синтеза образцов экспрессии (препаратов кДНК из клеток человека линии HEK293T с минимальным загрязнением плазмидной ДНК, использованной для процедуры кратковременной трансфекции); 5) мы получили данные высокопроизводительного секвенирования Illumina и установили нормированный уровень экспрессии для более чем 13 тысяч штрих-кодов, которые соответствовали более чем 8 тысячам уникальных мутаций 8-ми нуклеотидного участка, расположенного в позициях +29-36 после сигнала полиаденилирования. Мы выполнили поиск мотивов, которые как максимально снижают, так и максимально повышают количество транскриптов репортёрного гена eGFP. В целом, результаты проекта будут иметь важное фундаментальное значение в понимании регуляции экспрессии генов эукариот, а также практическое применение в плане развития геномных технологий, генетической инженерии и биотехнологий.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Проект направлен на исследование влияния различных последовательностей ДНК и локального состава хроматина на регуляцию экспрессии генов. Данный проект основан на использовании новейшего метода мультиплексного анализа TRIP (Thousands of Reporters Integrated in Parallel), который позволяет одновременно измерять уровень транскрипционной активности большого числа (до десятков тысяч), как интегрированных случайным образом в геном, так и не интегрированных в геном, трансгенов. Метод TRIP основан на piggyBac-опосредованной транспозиции в геном культивируемых клеток ДНК-маркированных (штрих-кодированных) репортёрных конструкций с последующей идентификацией сайтов их локализации в геноме и анализом их транскрипционной активности посредством высокопроизводительного параллельного секвенирования. Первая часть проекта связана с изучением активности промоторов разных типов в разных локальных окружениях хроматина в культивируемых клетках Drosophila melanogaster. Выбор модельного объекта для проекта был обусловлен тем, что для этих клеток имеются обширные массивы информации по взаимодействию компонентов хроматина с геномом, что позволило провести широкомасштабный анализ зависимости транскрипционной активности от локального состава хроматина. В рамках третьего года выполнения проекта нами был выполнен анализ штрих-кодированных данных, полученных на основе TRIP-популяций культивируемых клеток дрозофилы, несущих встроенные в геном гены-репортёры с выбранными промоторами. А именно, для каждого промотора была установлена функциональная зависимость между его активностью и составом эпигенетического окружения. Распределение репортёрных конструкций по геному в наших экспериментах оказалось неслучайным, как по отношению к разным типам хроматина, так и по отношению к расположению генов. Выявлена взаимосвязь между промоторным элементом, присутствующим в конструкции, и частотой интеграции конструкции относительно генов. Мы экспериментально на трансгенных линиях мух продемонстрировали посредством обратной транскрипции с последующей количественной ПЦР вариацию в уровне транскрипционной активности репортёрных генов yellow и mini-white в зависимости от их местоположения в репрессированных районах генома. А именно, были охарактеризованы тканеспецифические особенности эффекта положения хроматина на активность одних и тех же промоторных элементов в клетках жирового тела и нервных ганглиев личинок дрозофилы в районах генома, ассоциированных с хотя бы одним из белков-репрессоров: Polycomb (Pc), HP1 и/или Lamin Dm0 (Lam). Вторая часть проекта связана с исследованием процесса регуляции терминации транскрипции, а именно анализом регуляторных мотивов, расположенных после сигналов полиаденилирования. В рамках третьего года выполнения проекта нами был выполнен биоинформатический анализ мотивов в 3ʹ-областях генов, влияющих на число транскриптов репортерного гена eGFP, и проведена оценка их представленности в геноме человека. Также были проведены эксперименты по подтверждению значимости выявленных мотивов, посредством анализа репортёрных конструкций, не содержащих штрих-кодов, в линии культивируемых клетках человека HEK293T. Сравнение данных по экспрессии репортёрного гена eGFP, полученных с помощью количественной ПЦР в реальном времени и высокопроизводительного секвенирования Illumina MiSeq, показало, что предложенный нами метод хорошо работает для обнаружения мутаций, приводящих к усилению транскрипции целевого гена. Мы также обнаружили некоторое влияние штрих-кода на транскрипцию целевого гена. В целом, результаты проекта имеют важное фундаментальное значение в понимании регуляции экспрессии генов эукариот, а также практическое применение в плане развития геномных технологий, генетической инженерии и биотехнологий.